金刚线检测:分光光度法知多少

云梦县怀薇温度检测有限公司 技术支持 2020-03-26 10:04:27 0 溶液  测定  物质  曲线  
分光光度法知多少

分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析的方法。其应用光区包括紫外光区(200~400nm)、可见光区(400-760nm)、红外光区(760~10000nm)[1]。常用紫外光区和可见光区进行物质的测定,用紫外光源测定无色物质的方法,称为紫外分光光度法;用可见光光源测定有色物质的方法,称为可见光光度法[2]。

自1852年利用硫氰酸钾测定铁以来,这种利用分子吸收特性测定物质含量的方法至今已有百多年历史了,它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点,该法一直承担着微量组份分析的主要任务[3]。

定量分析

原理:朗伯-比尔(Lambert - Beer)定律。

当一束单色光通过一均匀溶液时,溶液对单色光的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。即A=abc,其中吸光系数a,表征吸光物质的灵敏度,a值越大,灵敏度越高;b为溶液的液层厚度(光程);c为溶液的浓度。当液层厚度b和吸光系数a固定时,吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时,首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况(吸收光谱),从中确定最大吸收波长 ,然后以此波长 的光为光源(单色光),进行吸光度A的测定,这是朗伯比尔定律用于定量分析的首要条件。

方法:标准曲线法、标准对比法等

标准曲线法:配制一系列不同含量的标准溶液,选用适宜的参比,在相同条件下,测定系列标准溶液的吸光度,做A-c曲线,即标准曲线,也可用最小二乘数处理,得线性回归方程。在相同条件下测定未知试样的吸光度,从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。

标准对比法:将待测溶液与某一标样溶液,在相同条件下测定各自的吸光度,建立朗伯-比尔定律,解方程求出未知样浓度与含量。

定性分析

使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液,测定此溶液对每一种单色光的吸光度,然后以波长为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制吸光度—波长曲线,此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线,因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定[1]。化合物对紫外光具有的吸收光谱特征:形状、峰的数目、波长位置及λmax(化合物特性参数)可作为定性依据进行化合物鉴定、结构分析、氢键强度测定、络合物组成及稳定常数的测定。

应用实例

随着广谱抗生素的使用,真菌感染比例越来越高,早期快速的诊断可以显著降低患者的死亡率。(1-3)-β-D葡聚糖是真菌细胞壁上的特异成分,通过测定患者血清中(1-3)-β-D葡聚糖的含量可准确反映出真菌感染的程度。(1-3)-β-D葡聚糖能特异性激活反应主剂中一系列酶联反应,最终产生显色物质pNA,从而引起溶液吸光度的变化,根据检测溶液405nm处吸光度变化对(1-3)-β-D葡聚糖浓度进行定量。

革兰阴性菌细胞壁上脂多糖也可作为生物标记物测定革兰阴性菌的感染情况,革兰阴性菌脂多糖可特异性激活反应主剂中一系列酶联反应,生成显色物质pNA,通过检测溶液405nm处吸光度的变化对革兰阴性菌脂多糖进行定量。一瑞生物专注于侵袭性真菌诊断20余年,拥有全套真菌检测方案,具备海洋生物开发平台、抗体制备平台、分子生物学开发平台、全自动医疗设备平台、仪器+试剂产业化平台。基于分光光度法研发的真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测试剂盒和革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒只需1.5h即可对相应生物标记物进行精准定量,达到早期、快速诊断的效果。

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